泛球生物网-专有技术

香精香料常用于食品、化妆品、医药、洗涤剂等工业。香料可分为天然香料、天然等同香料和人造香料3种。目前 ,在所生产的香味化合物中, 只有很少量的是从天然动植物中提取 ,而大约84 %的产品是通过化学合成法生产。也就是说 ,目前这些标着食品级的产品中的香精香料大多数都是通过传统生产方式在无机催化剂存在下化学合成的 ,其使用效果和安全性已经不能满足食品香精香料行业的发展需求。因此 ,急切需要寻找一种生产天然安全的香精香料的方法。
在生物技术不断发展的今天 ,研究者将目光集中到如何将生物技术运用于制备天然香精香料。与化学法相比 ,生物法制备的香精香料香味自然、持久、协调性好 ,不像化学法合成的香精香料 ,产生的是浮香 ,且香味单一 ;化学合成法生产的香精香料多数为消旋体的混合物 ,易造成香味的改变 ,而生物催化法具有专一的立体选择性 , 能在温和的条件下制备对映体纯的香精香料 , 香味纯正 ; 生物法中不采用各种无机催化剂和有机溶剂 ,避免了金属离子和有机溶剂的对食品和环境的污染。
当今 ,“ 祟尚自然,回归自然”已成为世界性不可抗拒的潮流 ,香精香料的发展也必然遵循这一发展趋势。于是 ,天然香料在市场上顿时身价百倍,远高于合成香料的价格。价格上的巨大差异也表明了用生物法生产天然香精香料的必要性。
1 生物技术在香精香料生产中的应用
早期有关微生物香料的研究主要集中在筛选可产生芳香化合物的微生物菌种上 ,而现今发酵工程，酶工程，细胞工程和基因工程等越来越多地应用于提高生物催化剂的催化效率。
1.1发酵工程在天然香精香料中的应用
发酵工程可采用生物合成法或生物转化法进行天然香精香料的制备。如内酯是广泛存在于自然界中具有生物活性的一类香精香料,在食品和化妆品工业中有重要的应用价值。生物合成法是指利用真菌和酵母菌的自身代谢作用 ,在静置期合成和积累对于细胞生长非必需的次生代谢产物 - 内酯 ; 生物转化法是指以羟基脂肪酸，非羟基脂肪酸和脂肪酸酯等为底物,在微生物体内酶的作用下转化成γ - 羟基脂肪酸 , 然后再进一步转化为内酯。
发酵工程在天然奶味香精中的应用比较广泛。微生物发酵法产奶味香精是指采用乳杆菌，乳链球菌等微生物 , 以牛奶或稀奶油为底物,发酵生产奶味香精的方法。由于微生物细胞内含有的酶系种类繁多 ,发酵产生的奶味香气多样化 , 包含有机酸、醇类、羰基类，各种酯类、内酯类、硫化物等近百种香味成分 ,与天然牛奶十分接近 ,其香气自然、柔和 ,是纯人工调配技术所难以达到的。此外 ,产品的赋香效果好 , 添加这类香精 , 牛奶的奶香味饱满、绵长、逼真 ,能明显提高加香产品的质量档次。
何杰以牛奶为底物 ,利用双乙酰乳酸乳杆菌发酵牛奶制备双乙酰奶味香精。实验证明, 向发酵液中添加0.01 mol/L CuSO4可提高双乙酰的形成活性, 添加 0.1 % 柠檬酸钠可部分阻遏双乙酰还原酶的产生。所制备的奶味香料具有双乙酰所特有的纯正的奶油香味。墨西哥的 ESCAM ILLA - HUR TADOML等，采用戊糖片球菌 Ped io2 coccus pen tosaceus和嗜酸乳酸菌L actobacillus acidoph ilus 的混合菌 ,以基于淀粉的培养基发酵可获得135. 76 m g /L 双乙酰 ,而当采用半固体的玉米基料为培养介质 , 其发酵产物中双乙酰的含量可达 779.56 mg/kg。深圳波顿香料有限公司利用乳酸菌首先对鲜牛奶或奶粉还原奶进行发酵处理 ,然后在发酵产物中添加奶油 , 再利用包括蛋白酶和 (或 )脂肪酶在内的生物酶制剂进行酶解处理 , 经过加热 ,浓缩 ,乳化均质获得具有鲜奶、炼奶、酸奶、奶酪、奶油等不同香气的奶味香料。该奶味香料中的丁二酮、丁位十二内酯、2 - 庚酮和二甲基硫醚等重要香料成分含量较牛奶增加了 100 ～500 倍。山东省食品发酵工业研究设计院从发酵乳中分出离优良产香菌用于牛奶发酵 ,大大提高了发酵液的香气强度 , 产品香气自然、柔和 , 可广泛用于冷食、液体奶、乳制品、焙烤、糖果等食品的赋香 ,也可作为调配奶类香精的香基。目前该产品已有 300 t / a中试生产线建成 ,实现了规模化生产。
此外 , 如 2 - 苯乙醇是一种具有玫瑰香味的芳香醇 , 是多种发酵食品的主要风味物质。化学合成法尽管成本廉价。但存在原料毒性高、合成过程污染大等弊端。王成涛等采用酿酒酵母在含有机溶剂的双相反应体系中 ,在添加 2-苯乙醇的前提物质 L-苯丙氨酸的情况下, 可使2-苯乙醇的产量达到2.21g/L ,与单水相反应体系相比 ,其发酵摩尔转化率提高了 8.6% , 部分克服了因高浓度2-苯乙醇对酵母细胞带来的的毒性作用。
吡嗪类化合物是加热食品中所具有的典型的香味成分 ,可赋予加热食品特殊的焙烤或坚果的风味。正常情况下是通过美拉德反应形成的 ,但有些微生物也能合成吡嗪类化合物 , 如谷氨酸棒杆菌 ( Corynebacterium g lu tam icun ) 是四甲基吡嗪的产生者,经5d发酵,产量可达3g /L又如假单胞菌 Pseudom onas taetrolens 能产生2-甲氧基-3-异丁基吡嗪 ,黄曲霉能产生2-羟基-3 ,6-二异丁基吡嗪等。陈玉勇等采用筛选得到的红酵母,在以蓖麻油为主要碳源的发酵培养基中，培养48h后可获得0.87g /L γ- 癸内酯。
1. 2 酶工程在天然香精香料中的应用利用酶工程可以生成许多香精香料的前体物质 ,一方面可拓宽香精香料的原料来源 ,另一方面可通过寻找廉价的原料,大大减少生产成本。
1.2.1酶法制备咸味香精
通常所说的咸味香精主要包括牛肉、猪肉、鸡肉等肉味香精。目前备受关的是采用还原糖与氨基酸、肽类、蛋白质等物质通过美拉德反应,产生肉类风味化合物,并且可通过改变原料、温度等工艺条件制备出风味不同的香味物质。而反应物中氨基酸来源的物质主要是通过酶解手段获得。如常用氨基酸来源物质有牛肉酶解物、猪肉酶解物、鸡肉酶解物、酵母抽提物(YE)、水解植物蛋白(HVP) 、水解动物蛋白(HAP) 、废骨抽提物等。其中 ,水解植物蛋白是一种营养型食品添加剂 , 以其柔和丰满的鲜美口感广泛用于肉产品加工、方便面、膨化食品以及调味品中。水解植物蛋白的制备主要以豆粕粉、玉米蛋白和花生饼等为原料 , 通过酸法或酶法水解将蛋白质分解成氨基酸和短肽。由于酸法水解会产生具有致癌性的物质 ,而酶法水解制备水解植物蛋白的产物是短肽和氨基酸,符合食品卫生的要求, 因此, 酶法水解植物蛋白制备肉味香精是当前的研究热点。武彦文等采用复合胰酶水解豆粕粉 ,获得香气强烈而协调的肉味香精。天津春发食品配料有限公司先利用米曲霉对牛肉进行固态发酵 ,再利用酵母菌进行二次发酵 , 二次发酵过程中物料的游离氨基酸含量迅速增加 ,为美拉德反应提供了前体 ,最后通过热反应得到的牛肉香精酱香浓郁, 口感醇厚饱满 ,后味悠长。
1.2.2酶法制备奶味香精
酶法制备奶味香精是指以稀奶油、牛奶等为主要原料,通过脂肪酶的作用将乳脂肪分解 ,从而得到增强150 ～200倍的乳香原料。以此为基础配制的奶味香精 ,香气柔和,是奶香加香的理想选择。这种方法的优点是由于酶对底物具有专一的识别性,改变反应条件就可能生成带有不同香味的产物,使产品风格富有变化,产品香气柔和,纯厚浓郁。
乳脂肪的主要成分是饱和脂肪酸甘油三酯 (约占55%)、不饱和脂肪酸甘油三酯 (约占43%) 、酮酸甘油三酯 (约占1% ) 、羟酸甘油三酯(约占1%) 。由乳脂肪产生奶香风味化合物的反应机理主要包括2个方面: 一方面是乳制品中的饱和脂肪酸在脂肪酶的作用下水解成各种饱和及不饱和脂肪酸，其中C4、C6、C8、C10、C12、C14含量较丰富 ,具有较高的香气贡献度, 是构成乳香的主要成分; 另一方面是不饱和脂肪酸被降解为醛类、β - 酮酸和羟酸类化合物, 其中β - 酮酸又会被进一步降解为甲基酮类 , 主要有甲基戌酮、甲基庚酮、甲基壬酮、甲基十一酮等; 羟酸生成各种δ- 内酯、γ - 内酯, 其中有δ- 辛内酯、δ- 内酯类、δ- 十二内酯等偶碳内酯。虽然这些甲基酮类和δ、γ - 内酯含量不高, 但对形成奶香的贡献却很大。张之涤采用来源于酵母的脂肪酶来水解奶油和稀奶油 ,发现当乳脂肪的水解率过高(>76%)时, 所产生的香气会又酸又臭,刺激性强 ,且口感似干酪,不太适合我国的消费习惯 ,而当奶油酶解率为55 % ～60 % , 酶解时间控制在3h～4h时,则可产生较原物质提高150 ～200 倍的酶解产物。
酶在非水介质中不仅能保持其生物活性,而且表现出许多突出的优点,近年来引起了研究者的广泛关注。如今 ,非水体系被运用到脂肪酶促乳脂肪水解制备奶味香精的研究中 ,即向反应体系中添加合适的有机溶剂, 在保持了酶的生物活性同时,又增加了疏水性底物的溶解度, 提高了反应效率 ,此外,有机溶剂的添加还能控制微生物的污染。研究证明,添加乙醇制备出来的奶味香精味道独特,与在水介质中的反应产物相比,奶味浓郁,但是乙醇的味道不能彻底消除, 在分离技术上还有待进一步提高和完善。
本课题组筛选了2种脂肪酶能水解奶油分别产生奶酪风味和甜香奶味的奶味香精,香味圆润丰满自然。此外,研究发现向奶油中添加适量乳清粉能进一步修饰奶香风味,改善口感。
徐岩等成功地分离出适合高效酶促反应体系中进行酶促转化的微生物,并制备成酶制剂 , 在底物浓度大于1. 0 mo l /L 的条件下 ,乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等短链脂肪酸酯转化率均超过90 % 。很多天然存在的硫醇类香料化合物含有手性中心,不同立体异构体 ,可能具有完全不同的香味特征。目前,关于酶催化制备硫醇类化合物方法有2类 :通过脂肪酶催化硫代醋酸酯类化合物的水解和通过β-裂合酶催化半胱氨酸加合物的裂解。

1. 3 细胞工程在天然香精香料中的应用
细胞工程包括细胞融合技术、动物细胞工程和植物细胞工程等。其中植物细胞工程在天然香精香料制备上的应用比较广泛。植物细胞培养是一种令植物细胞在培养基或培养液中生长的技术, 使植物的生长和收成易于控制 ,免受天气及其他环境因素的影响。植物香料属于次级代谢物，通常只在已分化的特殊组织中产生, 故在培养植物细胞生产香料时 ,需靠控制培养液的成分和培养的环境因素 ,加入引发因子及诱发细胞分裂化成植物特殊组织等以提高其次级代谢物的产量。香荚兰是世界上用得最广的香料。在利用植物细胞培养技术生产香兰素时,通过在培养基中添加一些植物激素(如2,4-二氯苯氧乙酸、苄基腺嘌呤和萘乙酸等) ,愈伤组织发生率大大提高 ,而且所形成的愈伤组织的继代培养生长较好。张树珍等将香荚兰的幼茎培养基上培养 ,形成白色、块状的愈伤组织来制备香兰素。曹孟德等还报道了氮源、碳源及吸附剂对香荚兰细胞悬浮培养产生香兰素的影响。又如均质的植物组织 (如莴苣叶) 可将亚油酸转化成顺-3-己烯醇和反-2-己烯醇, 二者是非常重要的香料，具有新鲜、青香气息, 主要应用于水果和蔬菜香精中。
1. 4 基因工程在天然香精香料中的应用
基因工程可以对某些微生物 (如大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母菌)的一个基因进行转移和表达, 由此可增加某种特定酶的产量,进而提高目的物的产量。基因工程在药物生产和农作物改良上已取得许多重大成果 ,而在香精香料工业上的应用还很少。双乙酰是具有强烈奶油香味的香料,被认为是乳发酵制品的滋味与香味中起重要作用的化合物之一。赵玲等采用紫外诱变筛选得到耐高浓度葡萄糖的高产丁二酮突变菌株UV-3,降低了乙醛脱氢酶、双乙酰还原酶和α-乙酰乳酸脱羧酶的活性,与出发菌株相比,突变株的乙偶姻产量降低了48.4%,丁二酮产量为1.045g/L,提高了18.7倍,具有良好的工业应用前景。通过基因工程将牛肉风味肽的基因附在α-factor载体上在酵母细胞中表达,所生产出来的酵母抽提物中含有较高浓度的风味牛肉肽,即可利用酵母进行发酵生产牛肉风味肽。将脱苦蛋白酶和风味醛氧化酶对应基因在菌体中克隆并成功表达,可利用建造的基因工程菌排去干酪香料中的不良风味。WACHEY等为了抑制菌体在转化蓖麻油为γ- 癸内酯的过程中的细胞生长,采用一株尿嘧啶缺陷型的基因工程菌 (Yarrow ia lipoly tica), 菌株在不含有尿嘧啶的培养基中进行生物转化蓖麻油酸甲酯,菌体生长受到抑制,转化率比原菌株提高了10 ～20倍。
2 结论与展望
随着人们健康意识的加强,对天然食品的关注度不断加大,对食品口感和香味的要求不断提高, 对食品安全的关切度逐渐提高,用生物法制备天然香精香料显然符合这一消费潮流。本课题组已经筛选出了2种脂肪酶,能水解奶油分别产生奶酪风味和甜香奶味的奶味香精,香味圆润、丰满、自然。此外, 向奶油中添加适量乳清粉能进一步修饰奶香风味, 改善口感。还筛选到了2株保加利亚乳酸菌能催化奶油生成具有圆润甜奶香味的奶味香精。后续研究中将研究所得奶味香精中的致香成分与奶香风味之间的关联, 为奶味香精的研制提供更多的理论依据。
由此可见, 用生物法制备天然香精香料给香精香料工业带来了一次革命性的突破。生物法制备天然香精香料的进一步发展必将促进广泛应用高效的绿色生物催化过程改造传统的化学过程, 以解决人类所面临的资源短缺、能源危机及环境污染等限制社会和经济发展的重大问题,也为食品添加剂行业其他天然食品添加剂如生物防腐剂、色素等的健康发展提供了一条良好的借鉴思路。