生物防治在农业微生物病害防治中的研究现状

化学合成农药是防治农作物微生物病害的主要手段之一，但随着人们对健康的关注程度提高、使用化学合成农药导致的环境问题以及抗药菌株的出现，其使用范围和效果逐渐减小，寻找替代方法是十分必要的。

生物控制，也称生物防治，是利用生物间的相互作用，包括寄生、捕食、拮抗、竞争等，达到控制有害生物的目的。拮抗是指指某种生物产生的代谢产物可抑制它种生物的生长发育甚至将后者杀死，有时因某种生物的生长而引起的其它条件的改变(例如缺氧、pH改变等)，从而抑制其他生物的现象也称拮抗。竞争是指两个种群因需要相同的生长基质或其它环境因子，致使增长率和种群密度受到限制时发生的相互作用，其结果对两种种群都是不利的。寄生是指一个种群从另一个种群的细胞或组织中获得营养，而对后者产生不利影响。捕食是一种种群被另一种种群完全吞食以获得营养。生物控制中使用的微生物称为生防微生物，也称生防作用物(bio-control agents，BCAs)。在农业微生物病害的生物控制中，生防微生物无论是单独使用还是与化学合成农药联合使用均表现出相当效果，被认为是最有前景的方法之一。

一个有效的生防微生物应具有以下特点：疾病控制效果好，应达到95%以上；可应用于多种作物；抗菌谱广泛，对多种病原微生物有效；在低使用浓度或剂量下即可发挥效果；可长期发挥效果；其安全性有保证，不能产生对人体有害的物质；对水果无致病性；环境友好；适应农业生产条件，包括低温、干旱等；兼容目前使用的化学合成农药；遗传稳定；营养要求简单，可使用低廉材料进行发酵生产；抗逆性强，易于加工和储藏(Spadaro，2004)。

目前国内外研究和使用的农业微生物病害生防微生物主要包括芽孢杆菌和酵母两类。

1.生防微生物的作用机制

目前对生防微生物的机制研究仍不充分，已知的机制包括以下几种：

产生抗菌物质：据报道效果较好的生防微生物均产生对病原菌具有毒性的物质，认为该机制是产生拮抗效果的主要原因。

营养和位点竞争：某些病原菌侵染农作物时，孢子的萌发或致病过程的启动需要某些营养物质或特异物质的诱导，孢子萌发后形成侵染垫或附着胞需要直接接触作物表面。生防微生物对营养物质和位点的竞争性利用阻止了病原菌的侵染。

寄生：寄生于腐败真菌的生防微生物主要是真菌，包括木霉和多种酵母，已报道菌株均能产生胞外细胞壁物质降解酶，包括几丁质酶、葡聚糖酶等。

诱导植物抗病性：非病原菌诱导的植物抗性(nonpathogen-mediated induced systemic resistance, ISR)和病原菌诱导的植物抗性(pathogen-induced systemic acquired resistance, SAR)具有相同的表型特征，包括感染处周围组织木质化和产生抗生素类物质，从而阻止病原菌的蔓延。

2 芽孢杆菌作为农作物病害生防微生物的研究

2.1 抗菌物质产生的拮抗作用

抗菌物质产生的拮抗作用：芽孢杆菌产生的抗真菌物质从合成途径分为非核糖体途径和核糖体途径。

2.1.1非核糖体途径

非核糖体途径产生的抗真菌物质包括脂肽类、多肽类、其他类物质。

A．脂肽类：具有表面活性剂性质，脂肪酸与若干个氨基酸形成环状内酯，疏水的脂肪酸链和氨基酸作用于细胞膜，扰乱膜结构，导致膜上离子通道的形成， 产生拮抗效果(Heerklotz，  2001)。 脂肽由非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs)合成。多个 NRPS 分子线性排列在一起以合成特定氨基酸顺序的肽。一个完整的 NRPSs 分子包含 3 个结构域。腺苷酰化结构域(A-domain)识别并通过腺苷酰化激活特定氨基酸，形成氨基酰-AMP。硫酯形成结构域(T-domain)，也称肽酰基载体蛋白(peptidyl carrier protein，PCP)，与脂肪酸合成、聚酮合成中的酰基载体蛋白具有同源性。 PCP 中含有4’-磷酸泛酰巯基乙胺(P-pant)， 通过硫酯键结合氨基酰， P-pant结合在一个 Ser 残基上，是在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(phosphopantetheinyl transferase, PPTases)催化下将 CoA 中的 P-pant 转移到 Ser 残基上。聚合域(C-domain)催化肽键的形成，接受上一个NRPS 分子中 T-domain 携带的酰基并与自身 A-domain 形成的氨基酰-AMP 形成肽键，延长的肽链被转移到自身的 T-domain 上。C-domain 不仅接受上一个 NRPS 携带的酰基，也可接受 CoA携带的酰基，例如脂酰基。某些 NRPS 分子中含有差向异构化结构域，将 L-氨基酸转变为 D-氨基酸。在 NRPS多酶体系末端的 NRPS 分子还含有一个硫酯酶结构域，负责将合成的肽从 PCP 上释放下来(Reuter，1999)。目前已报道的能够产生脂肽的种包括 Bacillus subtilis、B. cereus、B. lichenformis、B. amyloliquefaciens、B. pumilis等，对某些芽孢杆菌菌株基因组所作分析表明 NRPS 基因在 Bacillus属中广泛存在，但只有部分菌株具有 PPTases 基因，缺乏 PPTases 基因将导致 PCP 中的 Ser 残基无法与 P-pant 连接，失去携带氨基酰的功能，也就无法合成肽类。 筛选具有脂肽合成能力菌株往往通过指示菌拮抗法筛选，准确率不高，Kolusheva(2000)报道了一种快速筛选作用于细胞膜的抗菌肽的方法：磷脂与多聚乙二炔脂类(PDA)形成的颗粒，磷脂形成外膜，PDA为内含物。作用与膜的物质与磷脂相互作用导致膜结构扰乱，导致磷脂中脂肪酸碳链的扭曲，进而导致 PDA 分子的重排，产生蓝-红颜色变化。该方法灵敏度高并可定量检测，不仅能用于靶点为细胞膜的抗菌肽检测，还可用于多种膜相关研究中，具有广阔应用前景。

芽孢杆菌产生的脂肽主要包括 3 类：Surfactin、Iturin、Fengycin。

Surfactin 类：结构为一个 C12-17脂肪酸通过β-羟基和羧基与 7 肽 L-Gln/Glu、L-Leu、D-Leu、L-Val、 L-Asp/Asn、 D-Leu、 L-Leu/Ile/Val形成内酯， 氨基酸构型为 LLDLLDL。 主要包括 Surfactin(表面活性素)、Esperin、Lichenysin。广泛研究的是 Surfactin，由 B. sutbilis、B. pumilis产生，氨基酸顺序为 Glu、Leu、Leu、Val、Asp、Leu、Leu，由于具有良好的表面活性剂性质，目前已进行工业发酵生产。Lichenysin(Yakimov，1999)由 B. licheniformis产生，氨基酸顺序为 Glu、Leu、Leu、Val、Asn、Leu、Ile。Surfactin 类脂肽的的合成酶系包括 3 个蛋白，以 Surfactin 为例，其合成酶系为 SrfA-A、SrfA-B、SrfA-C，分别由 3、3、1个 NRPS 分子组成，负责 3、3、1个氨基酸的装配(吴清平，1998)。

Iturin 类：由β-氨基-C14-15脂肪酸通过β-氨基和羧基与 7 肽 L-Asn/Asp、D-Tyr、D-Asn/Asp、L-Gln/Ser/Pro、 L-Pro/Glu/Gln、 D-Asn/Ser/Pro、 L-Ser/Asn/Thr 形成内酯， 氨基酸构型为 LDDLLDL，Asx-Tyr-Asx 是其特征序列，包括 Iturin、Bacillomycin、Mycosubtilin 等。Iturin 类的合成酶系包括 4 个酶，第一个为丙二酰-CoA 酰基转移酶；第二个酶包含酰基-CoA 连接酶、ACP、β-酮-酰基合成酶、氨基酸转移酶和 1 个 NRPS 分子，负责β-氨基-脂肪酸和 1 个氨基酸的装配；第 3 个酶含有 4 个NRPS 分子，装配 4 个氨基酸；第 4 个蛋白包括 2 个 NRPS 亚基，装配 2个氨基酸。Mycosubtilin的氨基酸顺序为 Asn、Tyr、Asn、Gln、Pro、Ser、Asn，Bacillomycin D的氨基酸顺序为 Asn、Tyr、Asn、Pro、Glu、Ser、Thr，Iturin A的氨基酸顺序为 Asn、Tyr、Asn、Gln、Pro、Asn、Ser(Moyne,2004; Hiradate,2002; Cho,2003)。

Fengycin 类：包括 B. subtilis 产生的Fengycin、B. cereus 产生的 Plipastatin，由 10 个氨基酸组成，其氨基酸序列为 L-Glu、D-Orn、L-Tyr、D-allo-Thr、L-Glu、D-Ala/Val、L-Pro、L-Glu、D/L-Tyr、 L-Ile， 由第3个氨基酸L-Tyr和最后一个L-Ile与C16-19-3-羟基脂肪酸形成内酯， Plipastatin与 Fengycin 仅为 Tyr 构型不同，对丝状真菌具有高抑制性并能够抑制磷脂酶 A2 活性。Fengycin的合成需要 FenC、FenD、FenE、FenA、FenB 五个酶，分别负责 2、2、2、3、1 个氨基酸的装配(Volpon,2000; Lin,1999)。Kim等(2004)报道了具有相似结构的脂肽，由 L-Glu、D-Orn、L-Tyr、D-allo-Thr、D-Ala、D-Val、L-Pro、L-Ile 按 3:1:2:1:1:2:1:1 组成。

B．多肽类：芽孢杆菌产生的抗菌多肽包括环状、线状、分支环状 3 类。这类物质主要作用于细菌并多作为饲料添加剂、药品使用，在植物病害的生物控制中少见(陈中义，2003)。 环状结构最为常见，例如短杆菌肽 S(gramicidin S)、短杆菌酪肽(tyrocidine)为 Brevibacillus brevis 产生的环十肽；Mycobacillin 是 B. subtilis产生的环十三肽。裴炎等(1999)报道 B. cereus S-1菌株产生一种环状多肽 APS-1，由 Glu、Asp、Tyr、Ser、Thr、Pro、Leu、Ile、Val 和一种异常氨基酸组成。刘颖等(1999)报道 B. subtilis TG-26 产生一种抗真菌小肽 LP-1， 经 MALDI-TOF 质谱鉴定,分子量为1057.3,等电聚焦测得其 pI 为 4.75。LP-1 对温度有较高的稳定性,100℃保温 30min,仍能保持 75%的活性。抑菌谱表明,该抗菌肽对多种植物病原真菌有很强的抑制作用,LP-1 可造成绿色木霉菌丝生长形态异常:菌丝端部膨大,菌丝扭曲,分支加剧,菌丝内细胞质分布不均匀,发生凝聚。茚三酮反应以及测序结果均证实其为环肽。 何青芳等(2002)报道 B. subtilis A30 菌株产生一种对多种植物病原真菌有强烈抑制作用的物质，该物质分子量 1476Da，茚三酮反应阴性说明无自由 N端，酸水解后,茚三酮反应和双缩脲反应呈阳性，故推测为一种环肽。

线状多肽包括短杆菌肽 A(gramicidin A)和伊短菌素(edeine)。短杆菌肽 A由 15 个氨基酸组成的线性肽,其中8个是L-氨基酸,7个是D-氨基酸,  它具有疏水的侧链,  两个分子在一起形成跨膜的离子通道。伊短菌素由 5 个氨基酸和亚精胺组成，其中两个氨基酸为非蛋白氨基酸。这两种线状多肽均由 Brevibacillus brevis 产生。

分支环状多肽包括：多粘菌素(polymyxin)，包括 5 种成分，由 10 个氨基酸和脂肪酸组成，第 4 个氨基酸和 C 端氨基酸形成 7 肽环。枯草杆菌素(bactracin)由 12 个氨基酸组成，7 个氨基酸成环，5 个为线状。Octapeptin 包括 4 种成分，为 8 肽，含与多粘菌素相似的 7 肽环，线状部分只有一个氨基酸。

C.其他类物质

Zwittermicin A是线状聚酰胺类物质，在 B. cereus 群中广泛存在，对细菌和真菌具有广谱抑菌活性，对疫霉、腐霉属病原菌活性极强。 芽孢杆菌溶素(bacilysin)是由 B. subtilis 产生的2肽，由 L-Ala 和一个稀有氨基酸 L-抗荚膜菌素(L-anticapsin)组成，由氨基酸连接酶或 bacilysin 合成酶在 ATP 和 Mg2+存在下合成。 Anoxybacillin 是 B. cereus 产生的，由一个脂肪族氨基酸和甲基偶氮氧侧链组成，具有广谱抗真菌活性，机理为在转录水平抑制真菌硫吸收有关酶的合成，是发现的第一个真菌转录特异的抗生素。

多烯类物质对细菌、真菌具有抗性，已报道的有 bacillaene、difficidin、oxydifficidin 等，高学义等(2003)报道 B. subtilis B2 可以产生一种多烯类物质，可以抑制真菌孢子的萌发。谢海平等(2003)从香港清水湾海域中分离到一株能产生抗酵母样真菌和革兰氏阳性菌抗生素的 B. subtilis Bs-1，对 Bs-1 产生抗生素条件的研究表明,Bs-1 在多种培养基中生长迅速,但只在 PDB(马铃薯葡萄糖液体)中产生抗真菌活性物质。活性物质粗提液具有良好的耐热性和酸碱耐受性,121℃加热15min 及在 pH2 和 pH10处理 24h 仍有相当高的活性。用吸附、萃取、离子交换层析和 RP-HPLC等技术对此菌的抗菌代谢产物进行纯化,结果发现Bs-1在PDB培养基中发酵时至少产生3种亲水性的抗真菌活性化合物,三者在 C18 反相层析柱上的保留时间差别不大,对 HPLC 纯化后的其中一种化合物结构的初步分析表明该化合物含有共轭双键但无任何氨基酸残基,推测也可能是多烯类物质。 田黎等(2003)从海洋生境中分离筛选获得1株芽孢杆菌B-9987菌株,其分泌到胞外的代谢产物对植物病原真菌有显著的抑制作用，其中对茄交链孢菌、大丽轮枝菌、黄枝孢菌、立枯丝核菌主要造成真菌孢子或菌丝末端膨大成球状,继而胞壁崩解,原生质外泄；对尖孢镰刀菌和莴苣霜霉菌的抑制作用则表现为孢子萌发率降低和芽管长度明显变短。该抑菌物质经乙醚萃取,硅胶G薄层层析纯化,官能团显色反应初步推断为酚类化合物。

2.1.2核糖体途径

由核糖体途径产生的抗真菌物质主要是细胞壁多糖降解酶类，包括几丁质酶和葡聚糖酶，蛋白酶、脂肪酶对真菌细胞壁降解具有协同作用。芽孢杆菌产生的几丁质酶包括内切酶和外切酶，内切酶产生寡聚几丁质多糖，外切酶产生几丁质单糖。葡聚糖酶包括外切的β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶和内切的β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶。

Pyoung(2004)等在寻找对引起西瓜炭疽病的 Colletotrichum lagenarium的生防微生物时， 从土壤中分离出一株 B. amyloliquefaciens MET0908，单独培养时发酵液无抗菌性，只有与病原菌共同培养时发酵液才具有抗菌性，纯化后得到一个分子量约 40kDa 的蛋白，用胶体几丁质、壳聚糖、纤维素、β-1,3-葡聚糖作为底物测试发现该蛋白具有β-1,3-葡聚糖酶活性。该蛋白在 30-70℃下活性不变但在 100℃下处理 20min 后活性减少 50%。用激光共聚焦扫描显微镜观察菌丝形态发现该酶作用于细胞壁，导致菌丝膨大并断裂。 Wang 等(2002)从土壤中分离到两株可以以几丁质为唯一碳源生长的 B. subtilis菌株，在含有几丁质或海洋甲壳动物外壳的培养基中可以产生一种对 Fusarium oxysporum具有毒性的物质，并表现出几丁质酶活性。该物质对 pH不敏感，在 pH3、pH11 时活性均在 50%以上；对热稳定，100℃处理 30min 活性不变；50%浓度的发酵液对 F.oxysporum的抑制率达到 85%。 Helisto 等(2001)报道 Bacillus sp. X-b 是一株对多株植物病原真菌具有抗性的芽孢杆菌，能够产生几丁质酶、 壳聚糖酶、 β-1,3-葡聚糖酶、 脂肪酶、 蛋白酶。 采用均质处理的 Macrolepiota procera菌丝体可以有效诱导以上酶类的产生，效果优于胶体几丁质和部分纯化的 Polyporus squamosus菌丝体细胞壁。采用 Bio-Rad 的Mini-Protean II Electrophoresis Cell 系统对几种酶类进行了纯化，几丁质酶纯化 36 倍、壳聚糖酶纯化 69 倍、β-1,3-葡聚糖酶纯化 15 倍、脂肪酶纯化 44倍，几丁质酶有 2 个分子量为 46kDa 和 35kDa 的亚基组成，壳聚糖酶和脂肪酶分子量分别为 27kDa 和62kDa，均由一个亚基组成。 陈红等(2002)利用纹枯病菌细胞壁培养基富集产生几丁质酶的菌株，从 166 株几丁质酶产生菌中分离得到一株高产菌 X2-23，鉴定为圆孢芽孢杆菌(B. globisporus)，是一种新的几丁质酶产生菌。B. globisporus X2-23对所有的指示菌如水稻纹枯病、稻瘟病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、油菜菌核病以及水稻白叶枯病等多种病原菌均具强烈的拮抗作用。当 B. globisporus X2-23 加入上述病原真菌的液体培养基中时， 由光学显微镜和电子显微镜观察发现病原真菌菌丝发生扭曲、变形、菌丝细胞壁肿胀裂解、细胞质聚集、原生质体外溢或裸露等异常现象。该菌发酵液中几丁质酶活性达 25.5U/mL。 Chen 等(2004)报道来自 B. circulans WL-12 的几丁质酶基因 chiA，约 2.4kb，通过穿梭载体pHY300PLK转移到一株广谱抗真菌的 B. subtilis F29-3 中，该基因得到表达并在上清液中检测出几丁质酶活性，其抗菌能力得到显著提高。

2.2 位点占据

位点占据需要菌株具有在植物体表面和内部定植的能力，对此已有少数报道。Reva 等(2004)对从植物组织和土壤中分离出的 17 株芽孢杆菌进行鉴定，5株为 B. subtilis subsp. subtilis，3 株为B. subtilis subsp. spizizeni，2 株为 B. mojavensis，7 株与 B. amyloliquefaciens相似但有所不同。采用扫描电镜研究了这些菌株在植物根部定植能力，用种植试验研究了对植物的保护效果，并与菌株在平板上产生的抑菌圈大小进行了比较，发现菌株对植物的保护效果与根部定植能力正相关但与在平板上抑菌能力无相关性，说明平板法不能完全反应菌株的实际应用价值，植物活体保护试验是必需的。 Bacon等(2002)对13株B. mojavensis利用RifT突变株在植物体内的运动研究了它们在植物体内的定植能力，结果显示这 13 株 B. mojavensis均具有定植能力，可以成为植物内生菌，并表现出对 Fusarium moniliforme 的抗性，在平板培养中有 10 株能够抑制 F.moniliforme 的生长，并对植物生长具有促进作用。另外 14 株芽孢杆菌中(B. subtilis、B. atrophaeus、B. licheniformis、B. amyloliquefaciens、Paenibacillus lentimorbus、P. poppilliae)只有5 株能够定植。认为 B. mojavensis可能是一个定植能力较强的种，而植物内生菌是获得该种的一个较好来源。 Chen 等(1995)报道：对 244 株棉花内生菌的鉴定表明，伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、 假单胞菌属(Pseudomonas)是主要的棉花内生菌，所占比例分别为 26.2%、 18.1%、16.8%。对一株内生菌 B. pumilus JM-1128 的研究表明，该菌株对镰刀霉导致的枯萎病有较好的控制效果，发病严重程度为 1.75、2.42、0.83，对照为 2.50、3.42、2.00。该菌株在植物体内定植后可以生长繁殖，活菌数有一定上升。

2.3 诱导植物抗病性

Ongena等(2005)报道B. subtilis M4和病原菌Colletotrichum lagenarium、Pythium aphanidermatum没有任何接触的情况下可以降低病原菌对黄瓜和番茄的感染，认为机理是诱导植物抗性的产生。预先接种B. subtilis M4使植物对随后的病原菌感染更具抵抗力。在黄瓜上使用B. subtilis M4芽孢或活细胞具有同等效力，而使用芽孢杆菌产生的脂肽类抗真菌物质不能产生诱导抗性。对植物体的cDNA作AFLP分析显示接种B. subtilis M4后出现特异的条带，表明该菌株诱导了某些基因的表达。