β-内酰胺抗生素的酶法合成研究进展
β-内酰胺抗生素经过多年的发展，己成为抗生素中的最主要类型之一。由于具有良好的抗菌效力，较低的毒副作用，在临床上广泛应用，其发展非常迅速。现全世界耗用量已过万吨，预计今后还会增长。其中，青霉素和头孢菌素为最重要的两大类β-内酰胺抗生素。酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初，经过 30多年的发展，现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展，配套技术日益完善，具备了大规模工业化生产的条件，全球著名的β- 内酰胺抗生素生产厂家如荷兰DSM公司已有酶法合成的商品头孢氨苄、阿莫西林等产品面世。由于酶法应用于β-内酰胺抗生素合成，不仅可减少反应步骤，而且还可减少废弃物的产生，有利于保护环境，降低生产成本，产品质量优异，所含杂质极少。因此,21世纪β-内酰胺抗生素的酶法合成将是发展的必然趋势。我国酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大规模工业化生产，与国外先进厂家差距较大。随着我国经济快速发展，人们对自身居住环境的要求，政府对环保的重视，政府和越来越多的企业加大“绿色化学制药”的研究开发，特别是加快工业化生产的推进进程。现将近年来β-内酰胺抗生素合成研究、产品的分离纯化、酶反应器研究进行概述。
1 现状
青霉素中如氨苄西林、阿莫西林等，头孢菌素中如头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢克罗、头孢丙烯、头孢唑林等，这些产品有化学半合成法（简称化学法）和酶半合成法（简称酶法）。化学法是将母核与侧链以化学法缩合，现在世界上绝大多数生产这些产品的企业使用的是化学法，常用的方法有酰氯法、混合酸酐法、 Vilsmeier法及活性醋法。酶法则是将母核与侧链通过酶催化缩合。化学法需要较多的有机化学原料（如溶剂二氯甲烷、吡啶、二甲苯胺），反应条件苛刻，如需无水条件，反应温度低（有的需低至零下90℃），反应步骤多，产生大量的三废需处理。
这些产品酶法合成技术自1969年开始报道，但由于当时酶的性能较差，分离纯化技术也一直未能很好的解决，因此多年来酶法合成技术仍处于研究和试生产阶段。近年来，随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展，酶法制备β-内酰胺抗生素的技术也不断得到提高。
2 酶催化合成研究进展
2.1 酶催化酰胺化缩合反应
酶法制备β-内酰胺抗生素酰胺化缩合反应的研究涉及的品种有氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢丙烯、头孢克罗等。
酶催化缩合反应类型一般有两类，一类为热力学控制的酶催化缩合反应，另一类为动力学控制的酶催化缩合反应。
(1)热力学控制的酶催化缩合反应 其特点是不必活化酰基配体，废物产生少。Schroen等研究了不同pH,溶剂浓度和温度条件下，热力学控制的头孢氨苄酶法合成。pH5-8,酶的稳定性较好，pH4，酶的活性大大减弱；在水中直接合成，只有很少量的头孢氨苄生成，加入与水互溶的有机溶剂（甲醇和三甲醇二甲醚）有一定好的效果，头孢氨苄平衡浓度增加2-3倍，最大为0.25mmo1/L (36％三甲醇二甲醚，30℃,3d); 研究了不同侧链对产品平衡浓度影响，侧链有苯乙酸、 α-溴苯乙酸、L-马来酸、D-马来酸、对羟基马来酸、吲朵乙酸，研究发现，当侧链为苯乙酸，产品平衡浓度最大 (2.8mmol/L)，带有α羟基苯乙酸（即马来酸），产品平衡浓度小（最小0.6mmol/L)，结果表明，侧链结构对产品平衡浓度影响很大。酶可以是游离酶，也可以是固定化酶，来源E.coli。虽然，热力学控制的头孢氨苄酶法生产头孢氨苄，由于产品平衡浓度低，应用价值不大，但提示对某些β-内酰胺抗生素，由于侧链结构特性，热力学控制的酶催化缩合有可能实施。
Diender等报道了热力学控制阿莫西林酶法合成，在水溶液中，加人青霉素G酰化酶（来源E.coli），同时加入有机溶剂，提高阿莫西林合成平衡常数和合成缩合收率。
Ulijn等报道，以青霉素酰化酶（粗酶，游离态）为催化剂，通过沉淀产品制备酸性和两性离子β-内酰胺抗生素的研究。将苯乙酸和氨水溶液、底物6-APA （悬浮物）直接加人到反应器中，加人酶催化剂，一边反应一边将产品沉淀。这种热力学控制酶催化反应对青霉素G可行，但对两性β-内酰胺抗生素阿莫西林则不行。研究发现，通过加人某些相反离子，使其有利沉淀。阿莫西林阴离子与Zn++阳离子形成溶解性差的盐。 Zn++离子加入尽管使β-内酰胺降解，但使缩合收率增加至少30倍，产品平衡浓度可达30mmol/L。
由于热力学控制的酶催化缩合β-内酸胺抗生素反应，现阶段缩合收率还较低，应用价值还不大。
(2)动力学控制的酶催化缩合反应 此类反应酰基配体需活化，而酰基配体活化，一般是形成酰胺类化合物或酯类化合物。Vroom报道，将苯甘氨酸、对羟基苯甘氨酸制成相应的酰胺衍生物，在青霉素酰化酶作用下，此酶固定在包含凝胶和由氨基酸组成的多聚体上，酶来源于Escherichia coli、Acetobacter pasteuri- anum、Xanthomonas citrii、Kluyvera citrophila、Bacil- lus megaterium、Alcaligenes faecalis,反应温度0- 35℃，最适为100℃,pH5-9,合成了头孢氨苄、头孢羟氨苄、氨苄西林、阿莫西林。用此方法，也可合成头孢拉定、头孢克罗、头孢丙烯。Boesten等报道，7-ADCA 与苯甘氨酰胺缩合得到头孢氨苄，并将母核7-ADCA 从母液中回收。
van Doren报道将底物母核通过pH调节，使其达到过饱和浓度，在青霉素酰化酶（最好固定化）作用下（酶来源Acetobacter pasterurianuyn、Alcaligenes faecalis、Bacillus megaterium、Escherichia coli、Fusar- ium oxysporum、Xanthomonas citrii等），与相应侧链酰胺缩合，得到产品。这种方法比不将底物母核调到过饱和浓度，转化率高10％左右，母核与侧链摩尔比不大于2.5。用此方法合成了头孢克罗、头孢氨苄。
侧链形成酯类化合物中，形成甲酯的较多。 Youshko等报道，6-APA与侧链苯甘氨酸甲酯在青霉素酰化酶ATCC11105（游离态，来源Escherichia coli )作用下，合成氨苄西林。青霉素酰化酶催化水溶液中氨苄西林合成主要由初始底物浓度决定。比较了均相体系中和非均相体系中酶合成反应。在“水溶液-沉淀”非均相体系中，通过形成过饱和溶液进行，然后沉淀产品氨苄西林使得生物催化过程良好进行，使得氨苄西林转化率由6-APA计为93％。最近还有报道，侧链与多醇（如乙二醇）形成含羟基的酯，再与母核在酶的催化下缩合，转化率高达99％，此方法尤适于头孢丙烯、头孢羟氨苄的合成。
在酶法制备β-内酰胺抗生素的过程中，一般使用经固定化技术处理得到的固定化青霉素酰化酶，而早期使用的固定化细胞等形态的酶，因其形态结构和性能方面的缺陷，目前已不再使用。随着固定化酶技术进步，和对固定化酶在反应中失活原因的深人研究，固定化酶的使用寿命已经大大延长，半数失活(half-life)已经达到50-100批次。
在制备β-内酰胺抗生素的酶缩合反应过程中，不可避免地会产生逆反应——水解反应，即反应产物由于酶的作用再逆分解成原料，这对提高反应产率是很不利的，为提高酶缩合反应的产率，侧链对母核的投料量大大过量，这造成了侧链的过高消耗，并在产品中引入了不需要的杂质，对生产来说仍是不经济的。Maur- iZi报道酶缩合反应制备头孢氨苄，向反应体系中加人少量的酶抑制剂（苯乙酸、苯氧乙酸、扁桃酸等），可降低酶解作用，同时又不会对酶催化缩合反应产生太大的影响，从而可以得到较高的反应产率，大大降低侧链的投料量，使侧链与母核的投料比例降到2：1以下。
2.2 酶催化氯化反应
酶催化β-内酰胺抗生素合成研究，对其酰化缩合反应报道较多，最近，开始对酶催化氯化反应有研究报道。从微生物Rathayibacter种中分离制备对头孢菌素氯化过氧化物有活性的酶，在pH6.0磷酸盐缓冲液中，加人氯化钠和3％过氧化氢溶液，此种酶可将廉价的头孢氨苄转为价高的头孢克罗。仅有Rathayibacter biopuresis能产生头孢菌素氯化过氧化物酶。现转化率不高，如能提高转化率，将对头孢克罗的生产产生巨大的影响。
2.3“一锅法”酶法研究情况
酶法合成β-内酰胺抗生素，一般一步反应在一个反应器中进行，近年来，有人将几步酶法反应（例水解缩合或缩合缩合等）在一个反应器中进行，这样，不需分离中间体，简化了过程，有利于工业化生产，这将是酶法合成的趋势之一。
Ternadez-Lafuente等报道新型化学酶法合成头孢唑林，通过D-氨基酸氧化酶、戊二酰化酶和青霉素G酰化酶催化作用，生物转化头孢唑林。以头孢菌素C为起始原料，在水溶性中，经三步酶法和一步化学法合成头孢唑林，不分离纯化中间体，每步酶法收率接近100％。先将头孢菌素C酶法脱乙酰基，然后由 DAO和GA催化，再由PGA固定化酶（来源Esh- erichia coli ATCC11105)进一步催化酰化7-ACA，得到7-[(1H-四氮唑）-乙酰氨基]-3-乙酰氧甲基-△3-头孢烷酸，最后与MMTD侧链化学法缩合得到头孢唑林。
Wegman等报道，自苯甘氨酸腈二步酶法转化，一锅法制备头孢氨苄。腈水解酶（来源R. rhodochrous）催化水解D-苯甘氨酸腈为酰胺，然后在青霉素酰化酶(E.C.3.5.1.11)作用下，7-ADCA与 D-苯甘氨酰胺缩合，得到头孢氨苄。然后将1，5-二羟基萘加至反应液中，与头孢氨苄一起结晶，这使得反应液头孢氨苄浓度很低，避免了水解，收率79％，合成／水解比7.7。研究还显示D-苯甘氨酸腈显示对青霉素 G酰化酶有明显选择抑制效果。
Schnien等报道己二酰7-ADCA水解和头孢氨苄酶法合成一锅法完成，所用酶为固定酰胺化酶（来源 Escherichia coli），缩短了头孢氨苄制备过程。
酶水解 苯甘氨酸酯或酰胺
己二酰7-ADCA————→7-ADCA————————→头孢氨苄
青霉素酰化酶
3 产品的分离与纯化
在酶法制备β-内酰胺抗生素的技术中，产品的分离及纯化是一项关键性技术，由于所用原料侧链、母核和产品的理化性质相近，采用普通方法难以达到分离提纯的目的，因此该问题一直是酶法合成β-内酰胺抗生素生产的一大障碍。目前使用的回收纯化方法有多种，如：酸碱结晶法、浓缩结晶法、化学法（如萘复合物法）、柱色谱法、纳米滤膜法、两相萃取法等。这些方法各有
优缺点，还需进一步的改进和完善。 采用酸碱结晶法分离产品，可以不用有机溶剂，避免了对环境的污染。但是此法不能把产品一次分离干净，母液中残留的产品仍需浓缩结晶或其他方法加以回收处理，而且产品纯度也不够理想。
利用头孢菌素与萘类化合物形成复合物的方法比较简单可行，反应体系中的产品几乎可以定量地与萘类化合物形成复合物，从而得到完全分离。此法非常适合有酶存在的反应体系。如能解决回收蔡类化合物的问题，这将是一个非常好的分离纯化工艺。
Wegman等报道一锅法制备头孢氨苄，将1,5- 二羟基蔡加至反应液，与头孢氨苄一起结晶，这使得头孢氨苄浓度很低，避免了水解，收率79％。
Schroen等报道，在酶法合成头孢氨苄过程中，同时将产品通过与萘类衍生物形成复合物，这些复合物易结晶，复合物为复合剂与头孢氨苄按一定比例组成。复合物的形成利于防止不需要的水解。优化了反应条件,pH7.5,温度25℃为最适宜条件。讨论了产物形成复合物对反应的影响，在大多情况下，有好的影响，水解被抑制。特别是复合剂为1，5-二羟基萘，酶为液态酶，这样可得到高浓度的头孢氨苄。
采用两相萃取法分离提纯产品，是一个较好方法。 Hernandez Justiz等报道由动力学控制的酶法（自大肠杆菌的青霉素酰化酶）缩合头孢氨苄，通过连续萃取水溶性产品（周围是酶），从而使收率提高，这样，可避免酶快速水解。将酶以共价键固定于多孔载体上，反应开始前，孔状结构载体可以洗涤，用其中一相填充，这样，当事先平衡好的生物催化剂与第二相混合（那里反应产物将被萃取），固相酶保留于开始选择的第一相中。首次评估了在不同二相体系中头孢氨苄分配系数。在剧烈条件下，可获得高的分配系数。在100％聚二乙醇600-3mol/L,硫酸铵体系中，头孢氨苄被萃取到聚乙二醇体系中，可获最佳分配系数。固定化青霉素酰化酶在硫酸铵中，然后进一步悬浮于100％聚乙醇600 中，这样，可得到90％头孢氨苄合成收率，这里苯甘氨酸甲酯浓度150mmol/L，7-ADCA浓度l00mmo1/L。在这个反应体系中，固相酶留在硫酸铵水相中，由于将产品连续萃取到聚乙二醇相中，使头孢氨苄的水解得到抑制。相反，在单相体系中，由于头孢氨苄的快速水解，综合收率低于55%。
4 酶反应器研究
酶催化法合成β-内酰胺抗生素生物反应器主要有填充床生物反应器、搅拌槽式生物反应器、膜式生物反应器等，现研究较多的是膜式生物反应器。
Tarvascio等报道非均热膜生物反应器用于酶法合成头孢氨苄的情况。一种新的疏水性的催化膜，通过青霉素酰胺化酶E.C.3.5.1.11（来源Escherichia coli）固定在尼龙膜上，尼龙膜与甲基丙烯酸丁酯相连接，六亚甲基二胺和戊二醛分别作间隔基和偶合剂。以青霉素G酰化酶作催化剂，7-ADCA和苯甘氨酸甲酯缩合，对pH、温度、底物浓度等反应条件进行了考查。结果显示事先处理的酶有较好的结果，增加了固定化酶对pH和温度的稳定性。活化能的计算显示，通过固定化酶的生物催化制备头孢氨苄受到分散限制，导致酶活性和底物亲和性减弱。梯度温度作为减少分散限制性一种方法。实验表明，随着温度梯度变化，头孢氨苄呈线性增加，温度相差3℃，头孢氨苄合成增加 100％，产品制造时间减少50％。非均热生物反应器克服了分散限制性，Km值降至接近自由酶的Km值，减少由于固定化过程酶的失活。
Wenten等报道网状纤维膜反应器的情况，青霉素酰化酶E.C.3.5.1.11固定在膜孔上，连续水解青霉素G。研究了不同操作条件对固定化酶反应的影响。固定化结果显示青霉素酰化酶可固定90％以上。由于6-APA分子比膜孔小，溶质通过膜自由分散。然而，固定化酶截留了35％溶质。而且固定化酰化酶Km （8.04mm）比游离青霉素酰化酶(7.75mm)略高。低流速可以避免胶体形成或酶从膜孔释放，从而最大限度达到转化。
5 结束语
随着人们对β-内酰胺抗生素的酶法合成深人研究，相关的工业技术快速发展，人类对自身生存环境状况日益重视，β-内酰胺抗生素的酶法合成将是21世纪 β-内酰胺抗生素发展的必然趋势之一。
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