α-环糊精葡萄糖基转移酶的制备及酶法生产α-环糊精项目
一、项目简介
1、项目概述
环糊精葡萄糖基转移酶 (Cyclodextrin Glycosyltransferase，简称CGT酶，EC 2.4.1.19)是一种多功能酶，它能催化四种不同的反应：三种转糖基反应 (歧化反应、环化反应和偶合反应) 和水解反应。
目前国内外对CGT酶和环糊精的需求量逐年增加，但由于生产成本过高，限制了它们的扩大生产和应用。我国环糊精的生产虽有20多年的历史，由于生产菌种酶产量不高及生产工艺困难等问题，只有三种环糊精中水溶解度最小，可以很方便地通过分步结晶方法制得的β-环糊精已经大规模工业化生产。但是β-环糊精水溶性不好导致其使用范围较为狭窄。a和γ-环糊精虽然水溶性好，用途广泛，但是其生产工艺相对复杂，目前规模生产的量很少。
本项目针对a-环糊精生产中存在的问题，通过基因工程和蛋白质工程技术手段构建了可以大量制备a-环糊精的a-CGT酶工程菌，通过对工程菌胞外分泌途径的优化，获得了高产CGT酶工程菌的发酵工艺。通过对酶制剂的稳定性研究，获得了其稳定的储存条件。此外，还对上述a-CGT酶制备a-环糊精的酶转化及提取工艺进行了研究。这些前期工作为规模化生产a-CGT酶以及a-环糊精提供了技术基础。
2、知识产权
拥有自主知识产权。
3、市场分析及效益预测
随着应用领域的不断拓展，环糊精世界产销量一直呈现较大的增长，日本率先实现了β-环糊精工业化生产，并在环糊精生产与应用方面一直处于世界领先地位，美国、匈牙利、德国、荷兰等国紧随其后也对环糊精的生产与应用开展了大量的研究。目前，国际市场上生产和供应环糊精的公司主要有美国Corn公司、日本食品化工株式会社和盐水港精糖株式会社、德国Wacker公司、匈牙利化学产品公司及Cyclolab公司。这些公司在环糊精的研究和生产方面起步早、技术力量雄厚、产品系列化，在世界上有较大的影响。
近年来，环糊精生产增长率达到20%～30%，据了解，美国、日本等发达国家的环糊精总消费量已达十几万吨。由于β-环糊精在三种环糊精中的水溶解度最小，可以很方便地通过分步结晶的方法制得，因此目前工业生产中大量制备和广泛应用的是β-环糊精。但是β-环糊精水溶性不好导致其使用范围较为狭窄。a和γ-环糊精水溶性好，用途广泛，但是其生产工艺相对复杂，市场价格是β-环糊精的200多倍。
我国是环糊精进口国之一，在环糊精生产与应用方面的研究起步较晚。近年来，国内对环糊精的生产开发十分重视，应用研究也不断深入，国内环糊精生产厂家主要有广东郁南、陕西佳县、陕西志丹、陕西礼泉、辽宁方镇、苏州味精厂等，年生产能力已达1000吨左右，产品类型主要为β-环糊精，只有少量的a-环糊精，尚未有γ-环糊精的工业生产。α-环糊精目前市价约1800元/kg，极具市场开发前景。
我国淀粉资源十分丰富，开发环糊精具有原料优势。此外，环糊精也是国内市场上比较紧俏的化工产品，a-环糊精更是产需不足，仍靠进口弥补国内供需缺口。开发生产a-环糊精不仅能充分利用我国的优势资源，而且对促进食品加工工业和医药工业发展均具有重要意义。
4、项目进展情况
1）构建了高效表达a-CGT酶工程菌，通过实验室小罐初步发酵优化，20小时发酵液酶活达到50 U/mL(以α-环糊精的生成速率计)，35200 U/ml (以水解活性计)。发酵工艺条件正在进一步优化，发酵液酶活仍存在提升的潜力。
2）采用蛋白质工程技术对α-CGT酶的产物特异性进行了改造。获得了主产α-环糊精的突变体，该突变体转化淀粉的产物中α-环糊精比率比天然酶高55%。
3）研究了pH、酶蛋白浓度以及保护剂对重组酶的影响，获得了酶在常温下保存3个月其酶活不低于原酶95％的酶制剂储存条件。
4）建立并优化了以上a-CGT酶制备α-环糊精的酶反应条件及在线提取技术。环糊精总转化率可达到65% (w/w)，其中α-环糊精在产物中约占85%，转化产物中含有少量β-CD（15%），而极少形成γ-CD。
5、合作方式
技术转让、共同开发。
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