β-葡萄糖苷酶制备及酶法生产低聚龙胆糖项目
一、项目简介
1、项目概述
β-葡萄糖苷酶可水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。β-葡萄糖苷酶的水解活性在纤维素的完全降解中起到至关重要的作用，故其作为一种纤维素酶具有广泛的应用。近年来人们发现β-葡萄糖苷酶也具有转糖苷活性,可以将水解活性释放出的配基与葡萄糖体，以β-1，6糖苷键形式转移到其他糖底物上。采用该酶的转苷活性可生产低聚龙胆糖。
低聚龙胆糖是一类由葡萄糖以β-1，6糖苷键结合形成的新型功能性低聚糖，包括龙胆二糖，少量的三糖和四糖。摄入适量龙胆低聚糖，可以改善肠内菌群、增加粪便中的有机酸含量、降低粪便的pH、改善通便的生理作用。具有增殖肠道有益菌、抑制腐败菌的生理功效。
制取龙胆低聚糖方法较多，最早是从龙胆属茎、根中提取，但由于受原料等条件的限制，市场价格偏高，而且制得的龙胆低聚糖制品苦味较重，这使它难以作为食品配料使用。除此之外，还可利用还原苦杏仁苯法和酸法水解淀粉后从其副产物中提纯，这种方法也未能实现工业化生产。随着酶法制取低聚糖的兴起，工业生产低价格的龙胆低聚糖制品已成为可能。低聚龙胆糖的酶法生产目前在西方国家尤其在日本最为广泛，国内低聚龙胆糖市场急待开发。
本项目通过基因工程技术构建高效表达β-葡萄糖苷酶的工程菌，优化了工程菌的发酵工艺条件。此外，利用制备得到的β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖生产低聚龙胆糖，经过简单的分离纯化，可有效地去除葡萄糖。而分离出的葡萄糖可重新作为酶反应底物循环利用，大大降低生产成本。
2、知识产权
拥有自主知识产权。
3、市场分析及效益预测
β-葡萄糖苷酶用途广泛。其可水解纤维素，高效水解纤维素是燃料乙醇生产的关键之一。纤维素的酶水解是在纤维素酶系中内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的协同作用下完成的。β-葡萄糖苷酶除了水解纤维素，利用其转苷活性还可生产低聚龙胆糖；作为风味酶，其可作用于茶叶、水果、蔬菜中的酶前体物释放出挥发性糖苷配基，起到增香作用，提高果汁品天然风味；其还可将苦杏仁苷分解为苯甲醛及氢氰酸和两分子葡萄糖，使苦味大大减少；此外，根据β-葡萄糖苷酶的半乳糖酶活力还可以将其应用于乳品业来分解乳糖，与其它酶协同作用生产葡萄糖与单细胞蛋白，应用于饲料工业和医药领域等。
龙胆低聚糖是近年来开发的一种新型的功能性低聚糖。与其它功能性低聚糖相比，龙胆低聚糖有柔和的提神苦味，苦味比柑桔皮所具有的柚皮苷苦味更丰富更微妙，且还会在口腔中滞留，用于糖果、饮料、冷饮中可使其甜味更纯。它比蔗糖和麦芽糖浆的吸湿性强，可以保持各类食品中的水分，防止淀粉类食品的老化，延长货架期。它是低热、低甜物质，难被人体消化酶所分解，因而可以促进双歧杆菌的生长，从而起到改善结肠状况的作用。龙胆低聚糖对热和pH十分稳定，可用于其他一些低聚糖不适宜使用的保健品中，如酸性和需加温处理的食品。目前低聚龙胆糖已应用于咖啡果冻、奶油冰激凌、豆沙酱、巧克力、烘烤食品、果酱、调味品、果汁饮料、发酵饮料、咖啡等。
日本的Nihon Shokuhin Kako公司是目前已知的唯一生产龙胆低聚糖的厂家。生产的低聚龙胆糖产品主要有两种规格：Gentose#45和Gentose#80，即低聚糖的含量分别约45%和80%。由于龙胆聚糖具有令人愉快的甜香味，可直接添加于各种食品饮料中以提高其保健营养价值。日本清酒、大酱和酱油等发酵食品之所以有一种特别的甜香味其原因与这些食品均含龙胆聚糖成分有关。我国在两年前亦已开始试产龙胆低聚糖，但产量较小，目前还没有大规模的产品。目前低聚龙胆糖市场价格约700元/公斤，作为一种功能性食品添加剂新资源，低聚龙胆糖无疑具有广阔的市场前景。
4、项目进展情况
（1）、将黑曲霉来源β-葡萄糖苷酶基因克隆表达于毕赤酵母。利用重组毕赤酵母工程菌高密度发酵制备β-葡萄糖苷酶。发酵周期80小时左右，发酵液酶活达到2015 U/mL（以对硝基苯酚为底物）以上。发酵液经离心后可作为粗酶液使用来进行生物转化反应。粗酶液在室温放置三个月酶活保留95%以上。
（2）、利用β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖生产低聚龙胆糖，转化周期48小时，反应产物中低聚龙胆糖浓度达到50g/L以上。
（3）、经过简单的分离纯化，可有效地去除葡萄糖，产物中低聚糖含量达到80% 以上。分离出的葡萄糖可重新作为酶反应底物循环利用。
5、合作方式
技术转让、共同开发。
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