微生物转化技术在现代医药工业中的应用
1，概述
在已往的30多年中，微生物转化或酶转化妙技在有机化学合陋习模中的考试测验不只使理论研究得到普及开展，在实际应用方面也取得了长足的提高。良多化学合成工艺相称庞年夜的药物、食物添加剂、维生素、扮装品和其余一些风雅化工产品合成历程中的某些紧张回响，今朝已经能够用微生物或酶转化妙技得以更换。在良多海外文献中通俗能够看到的描写这种妙技的名词有：microbial transformation、microbial conversion、biotransformation、biotransconversion和enzymation等［1，2］。微生物转化的本质是某种微生物将一种物质(底物)转化成为另一种物质(产物)的历程，这一历程是由某种微生物孕育产生的一种或几种希罕的胞外或胞内酶作为生物催化剂举办的一种或几种化学回响，简言之，即为一种操作微生物酶或微生物本身的合成妙技。这些具有生物催化剂浸染的酶年夜年夜都对其微生物的生命历程也是必须的，但在微生物转化历程中，这些酶仅作为生物催化剂用于化学回响。因为微生物孕育产生的这些能够被用于化学回响的年夜年夜都生物催化剂不只能够操作自身的底物及其近似物，且偶尔对外源添加的底物也具有同样的催化浸染，即能催化非天然的回响(unnatural reactions)，因而微生物转化可以以为是有机化学回响中的一个希罕的分支。某种希罕的微生物能够将某种特定的底物转化成为某种特定的产物，其本质是酶的浸染。是以，对酶转化无需多作评释，它与微生物转化的分比方仅在于：前者是一个单一的酶催化的化学回响，而后者为了实现这一酶催化回响，必要为微生物供应一个能够生物合成这些酶的前提，是以，从这一角度来看，这似乎是真正的生物转化。此外，只管用于生物转化的酶年夜多来自于微生物，但也可所以来自于动物和植物的酶。而对付一个详细的生物转化来说，实情是授与微生物转化妙技，照样授与酶转化妙技，这要综合思量实现这一历程的诸多身分，如本钱、环境、妙技装备和质量要求等。在研究一个微生物(或酶)转化历程时，必要细心地思量诸多方面的题目如：所用转化底物的选择、所用微生物对差别底物转化手段的考查、转化蹊径或转化回响的选择等。其中最首要的是探求得当于所计划转化历程的微生物，以及怎样来进步这种微生物的转化手段，即进步这种酶活力。再则是发明一种新的酶或一种新的回响以便为计一律个新的微生物转化历程供应一条线索。为了探求能够适相助为生物催化剂的微生物酶，除了有须要对原本已知的一些紧张的酶或回响举办从头评价外，一种更为有效的要领是筛选新的微生物菌株或酶［3～6］。用于微生物转化的菌株或酶的筛选的领域应该尽年夜概地广，由于至今朝为止已经发了然3000余种能够催化各类化学回响的酶，其中有些酶的催化下场比化学催化剂好；此外，微生物的多样性和其心理生化特征的多样性(它们能够润色和降解许良多多有机化合物)，使我们有年夜概找到某种微生物或酶来催化某种特定的和所祈望的化学回响。
2，生物转化与药物开发的应用
愈来愈多的研究剖明，作为治疗用药物的外消旋体殽杂物有着不成休止的错误舛错，而美国FDA发布的手性药物引导原则无疑加快了从新起头开发单一异构体药物或操作外消旋体转换妙技从已有的药物中开发单一异构体药物的步骤。手性药物制备的关键妙技是不同错误称合成妙技。多年来，有机化学事项者已经研究开发了良多种用化学的要领举办不同错误称合成的妙技，但近20多年来，很多耐久从事化学合成研究的事项者对微生物和酶回响产生磷鞴胖趣，与此同时，很多耐久从事微生物和酶的研究的事项者对怎样将此应用于有机合成产生磷鞴胖趣，从而使生物催化转化(biocatalytic transformation)成为一种举办不同错误称合成的紧张妙技。应用生物催化转化妙技举办不同错误称合成与化学合成法对对照具有的优胜性有：1)转化底物某一基团的埋头性强，即对不必要转化的基团无需掩护；2)经由过程对用于某一转化的微生物举办菌种选育和转化前提的优化，可以获得极高的转化率；3)生物催化转化的回响前提温顺且对环境的污染很小。出格是连年来DNA重组妙技的应用和新的转化体系的开发应用，使愈来愈多的原本使用化学要领举办不同错误称合成的化合物有年夜概被生物催化转化的要领来更换［7～10］。操作生物转化妙技举办手性药物的开发首要举办两个方面的事项：一是举办药物关键中心体的制备，由于操作生物催化转化要领制备对映体纯化合物(enantiopure compounds)具有很年夜的吸引力，但试图操作这种要领来完成所祈望的庞年夜的有机合成每每是坚苦的，乃至是不成能的，而操作这种要领得到某一关键中心体是确切可行的；此外，只管用化学的要领能够在尝试室前提下得到所必要的手性药物，但每每是因为本钱和妙技题目难以实现财富化。是以用化门生归天学的制备蹊径具有独特的优胜性，即所谓的“绿色合成工艺”；二是举办消旋化合物的生物拆分或转化，获得单一构型的药物分子。表1为一些操作生物转化制备手性药物或关键中心体的实例［11］。
3，组合生物催化与新药发明组合
生物转化(催化)(combinatorial biocatalysis)，是指操作一种以上的具有希罕转化成果的微生物或酶，对同一个母体化合物举办组合转化，以获得化学结构的多样性，它是从已知化合物中探求新型衍生物以及从年夜略化合物制备庞年夜化合物的有效手腕。从某种角度讲，它比化学合成的要领更为年夜略和有效。这是一个新的研究规模。天然产物的多样性和其结构的庞年夜性，是存在于生物体内年夜量酶的浸染功效。生物体内认真一系列紧张生命勾当的酶，在体外同样具有不异的催化手段。是以，只要体外的催化环境与体内相仿，则能够实现一系列庞年夜的，出格是用传统化学合成要领难以实现的化学回响。操作生物催化剂或化学合成酶催化相联络的要领，能够年夜年夜地增进衍生物的多样性，以及能够有效地对庞年夜天然产物的功效润色和从年夜略的分子构建新的化合物库，在这历程中，每每能够发明新的心理活性物质。生物催化剂为扩年夜组合化学供应了各类合成的年夜概性［1，11～13］。表2为一些由酶或微生物催化的规范回响。操作生物催化发明先导化合物的优胜性在于：1)年夜概举办回响的领域广；2)能够定向举办地区选择性和立体选择性；3)不需基团掩护和脱掩护，一步实现所需的回响；4)在温顺和均一的前提下可轻易地实现自动化和一步回响的重现性；5)温顺的回响前提保证了庞年夜易变的分子结构的不变性；6)高的催化活性可以低落催化剂的用量；7)酶的坚贞化可以使催化剂重复和轮回使用；8)生物催化剂可在环境中完全被降解。
4，连年来本中央开展的一些相干课题的盼望
连年来，上海来益生物药物研究开发中央起头涉及微生物转化课题的研究，出格是用微生物举办植物甾醇边链降解制备甾体药物关键中心体的开发以及抗糖尿病新药米格列醇和伏格列波糖的开发。
表1 操作生物转化制备手性药物或关键中心体的部分实例（略）
4.1 甾体类微生物转化的研究甾体药物包孕激素类药物和非激素类药物：前者如性激素、类皮质激素和蛋白夹杂激素等；后者有抗细菌和抗肿瘤药物等。因为其不成庖代的用途及治疗适应证一直扩年夜，甾体药物越来越引起人们的正视。操作生物转化妙技举办甾体药物出产首要有植物甾醇的边链切除，以获得关键中心体ADD和4AD，以及举办立体选择性的羟化回响。(1)操作微生物转化切除边链，制备甾体药物关键中心体ADD和4AD微生物对甾体边链的裂解转化是一个很慢的历程，由于底物和产物的消融性都很差，且底物转达至细胞的历程和产物传出细胞的历程都很慢。是以，怎样进步底物的消融性一向是进步微生物转化率的紧张轨范。我们在微生物转化菌株的菌种选育、转化前提的优化和转化体系的研究方面举办了数年的研究事项［14～17］，终极已经得到了具有财富化代价的微生物转化妙技，即以天然维生素E出产下脚料(含有殽杂植物甾醇)为底物制备甾体药物关键中心体ADD和4AD的家产化蹊径。图1所示为殽杂植物甾醇底物和ADD以及4AD的化学结构。(2)操作微生物转化选择性羟基化，制备甾体药物关键中心体11OHADD、11OH4AD，以及抗心衰新药依普利酮关键中心体11OH坎利酮我们分袂举办了以ADD、4AD以及坎利酮为底物的微生物转化菌株的筛选、选育，以及转化前提的优化等年夜量研究事项，终极得到了具有财富化代价的微生物转化制备工艺。图2所示为11OHADD和11OH4AD的化学结构。图3所示为从坎利酮到11OH坎利酮的微生物转化。(3)操作微生物转化妙技，得到多种4AD结构近似物很多甾体药物的关键中心体与4AD的结构近似物有关，我们筛选了多种具有差别特征的微生物菌株对4AD举办转化，功效获得了一系列的4AD结构近似物，如图4所示［18］。(4)操作微生物转化妙技，从植物殽杂甾醇直接出产睾酮在我们多年对植物甾醇微生物转化边链切除的研究历程中，发了然一个很是故意义的征象：即在经由诱变措置赏罚赏罚的年夜量微生物转化菌种中，发了然一株能够直接将植物甾醇转化成睾酮的菌株［19］。同时，转化前提的变化能够使睾酮的转化率年夜年夜地进步。进一步的研究剖明，能够将植物甾醇直接转化成年夜量睾酮的微生物菌株，其17羰基还原酶的活性对照高，因而将已经转化的ADD和4AD中17位的羰基还原成为羟基，分袂得到睾酮和去氢睾酮，以及此外一个17位边链产生变化的结构近似物，如图5所示。经由年夜量的菌种选育事项和转化前提的优化事项，已经得到了一条操作微生物转化直接从殽杂植物甾醇制备睾酮的家产化工艺蹊径。
图1 底物殽杂植物甾醇和产物ADD以及4AD的化学结构（略）
图2 11OHADD和11OH4AD的化学结构（略）
图3 从坎利酮到11OH坎利酮的微生物转化（略）
图4 操作微生物转化4AD获得的一系列结构近似物（略）
图5 睾酮和去氢睾酮的化学结构（略）
4.2降糖药物米格列醇的研究开发米格列醇(miglitol)的发明源于对微生物发酵产物野尻霉素的研究，研究表现该原本作为抗头陀氏菌的抗生素具有较强的α葡萄糖苷酶按捺浸染，继而成为第一个具有开发代价的淀粉酶按捺剂。1脱氧野尻霉素(1deoxynojirimycin)由野尻霉素还原而得，也可由多种链霉菌和芽孢杆菌孕育产生，同样具有糖苷酶按捺浸染。N庖代1脱氧野尻霉素具有更好的降糖下场，米格列醇便是其中之一。米格列醇的结构与葡萄糖相似，能够可逆地竞争性按捺假单糖α葡糖苷酶，淘汰单糖的代谢，低落在小肠的领受。图6所示为葡萄糖、1脱氧野尻霉素和米格列醇的化学结构。按照文献报道，有多种制备米格列醇的化学合成工艺。其中有以6脱氧6氨基山梨醇为质料，经雷尼镍催化还原后，再与环氧乙烷回响而成。也可以先与环氧乙烷回响后，再在钯碳催化下还原制得。此外，也有多种操作生物转化和化学合成相联络的要领，以及先用微生物发酵制备野尻霉素或1脱氧野尻霉素后再用化学合成的要领来制备米格列醇［20］。本中央研究开发的米格列醇制备工艺授与生物转化与化学合成相联络的要领，扼要工艺流程如图7所示。本制备工艺的关键是筛选具有高效氧化氨基葡萄糖的微生物菌株，以及能够实现财富化的转化工艺。
4.3 降糖药物伏格列波糖的研究开发伏格列波糖(voglibose)是新一代的α葡糖苷酶按捺剂，最初是从某种放线菌作育液中发明的氨基糖近似物，口服后能竞争拮抗性地按捺肠道内双糖类水解酶(α葡糖苷酶)，延缓糖尿病患者餐后血糖的迅速上升从而按捺餐后高血糖。同时伏格列波糖较着低落身材的脂肪量，肥胖的减轻使胰岛素受体敏感性增进，进而使空肚血糖徐徐较着降落。据文献报道，伏格列波糖的制备除了经由过程全化学合成得到外，另有以下几条蹊径：一条蹊径是由有效霉素孕育产生菌发酵，从发酵液中疏散出年夜组分有效霉素A，经生物转化后获得关键中心体valienamine和validamine，再经由化学合成即可获得终产物；或是从有效霉素发酵液中疏散出小组分有效霉素G，生物转化获得关键中心体valienamine和valiolamine，两者经恰当轨范的化学合成回响后即可获得终产物；第二条蹊径是从有效霉素发酵液中疏散出小组分valienamine，经化学合成后获得终产物；第三条蹊径是从有效霉素发酵液中疏散出小组分valiolone，同样经恰当化学合成回响后获得终产物；第四条蹊径是由D葡萄糖经一系列的化学回响直接合成获得终产物。其流程如图8所示。本研究中央操作第一条工艺蹊径，筛选得到了具有高转化效用的微生物菌株，以及得当家产化出产的转化工艺。
图6 米格列醇、野尻霉素及1脱氧野尻霉素、αD葡萄糖的化学结构（略）
图7 米格列醇的制备工艺（略）
4.4 N乙酰神经氨酸的研究开发N乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是合成抗病毒药物扎那米韦的前体，其本身也具有多种紧张的应用代价。今朝有三种差此外生物转化要领制备Neu5Ac(图9)：路子Ⅰ是一个相对年夜略的醛缩回响；路子Ⅱ涉及到回响前体ManNAc的磷酸化；路子Ⅲ所合成的产物Neu5Ac9P必要进一步用此外的酶脱磷酸化。这些合成要领均可在体外举办，今朝已经用于家产化出产的是路子Ⅰ。
本中央授与路子Ⅰ的生物转化要领，首先从E.coliC600中乐成地扩增了N乙酰神经氨酸裂合酶基因(nal)，经由过程同源性对照发明，它与来历于E.coli K12的nal序列完全同等。氨基酸序列比对功效剖明，136和164位的氨基酸也为赖氨酸和酪氨酸，与文献报道的活性中央位点同等。进而，将该基因经由过程EcoRI和BamHI两个酶切位点，严厉节制肇始密码子和启动子间间隔的情形下克隆到高表达载体pYG5上，构建成新的质粒pLY2，并举办其表达研究。然后对粗酶的制备、转化前提的优化、剖析检测要领的成立，以及产物的疏散纯化等举办了研究， 初阶得到了一条得当家产化出产N乙酰神经氨酸的蹊径。
图8 制备伏格列波糖4条差别工艺蹊径（略）
图9 三种差此外生物转化制备Neu5Ac的要领（略）
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